Bakterien, die in Form kommen: Genetische Determinanten der Morphologie von E. coli

OBSERVATION

Bakterielle Zellformen repräsentieren Milliarden von Jahren evolutionärer Verfeinerung. Ihre geringe Größe führt zu einem hohen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was ideal für den Nährstofftransport, die effiziente Atmung und die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität ist. Es ist bekannt, dass die Gesamtzellform durch eine Fülle von zellulären Prozessen und Umwelteinflüssen gesteuert wird (1-3). Es wird jedoch schnell zu einer Herausforderung, genau zu bestimmen, wie sich Variationen in der Form auf die Zellfunktion auswirken. Genomweite Daten, die den genetischen Beitrag zur bakteriellen Morphologie beschreiben, sind ein Schritt zur Beantwortung dieser Frage. Darüber hinaus repräsentieren die resultierenden Interaktionsnetzwerke mehrere miteinander verknüpfte biologische Netzwerke, die sich aus verschiedenen Form-Phänotypen ergeben. Hierin beschreiben wir eine genomische Momentaufnahme der Morphologie von Escherichia coli K-12 in der mittleren exponentiellen Phase unter Verwendung der Keio-Deletionssammlung (4). Darüber hinaus charakterisieren wir genetische Interaktionen zwischen Deletionen, die die Form beeinflussen, und dem E. coli-Genom mit Hilfe von Hochdurchsatz-Konjugation (5, 6).

Die von uns entwickelte High-Content-Imaging-Plattform ist speziell auf die komplizierte Aufgabe der bakteriellen Bildgebung zugeschnitten. Die Bildgebungszeiten für Mikrotiterplatten mit hoher Dichte (384- oder 1.536-Well) können die ca. 20-minütige Verdopplungszeit von E. coli weit überschreiten, was eine zeitliche Herausforderung für die Bildgebung von Genombibliotheken innerhalb einer gemeinsamen Wachstumsphase darstellt. Darüber hinaus stellt die Motilität lebender Bakterienzellen eine zusätzliche Schwierigkeit bei der Begrenzung der Mobilität der Zellen während der mikroskopischen Abbildung dar. Wir begegneten diesen Herausforderungen, indem wir ein Glutaraldehyd-Fixiermittel verwendeten; ein üblicher erster Schritt bei elektronenmikroskopischen Präparationen und bekannt dafür, die Zellform mit vernachlässigbaren Auswirkungen bei der Auflösung der Lichtmikroskopie zu erhalten (7). Die Zellen wurden dann in Glasboden-Imaging-Platten (0,17-mm-Dicke) mit Nigrosin negativ gefärbt und sanft hitzefixiert, wobei alle Zellen auf eine gemeinsame Fokusebene gebracht wurden. Dadurch wurde der Phasenkontrast überflüssig, der bei 384-Well-Mikroplatten und Mikroplatten mit höherer Dichte aufgrund der Blockierung des Lichtkegels vom Phasenring nicht durchführbar war. Durch die Verwendung eines Hellfelds konnte mehr Licht durch die Probe gelangen, was zu einer schnelleren Belichtung und einer besseren Fokusgenauigkeit führte. Die auf diese Weise vorbereiteten Platten können unbegrenzt oft neu belichtet werden, und die Bildqualität verschlechtert sich nicht mit der Zeit, was eine hochauflösende Bildgebung von Proben ermöglicht, die in einer bestimmten Wachstumsphase fixiert wurden. Die resultierenden Bilder zeigen einen starken Kontrast zwischen Zellen und Hintergrund, was für die quantitative Bildgebung sehr wünschenswert ist (Abb. 1; ausführlich in Text S1 und Abb. S1 im ergänzenden Material). Zehn morphologische Merkmale wurden pro Knockout quantifiziert: Fläche, Umfang, minimale Ellipsenachse, minimale Feret-Länge, Haupt-Ellipsenachse, Haupt-Feret-Länge, Kreisform, Rundheit, Seitenverhältnis und Festigkeit. Wir nutzten dann die Hauptkomponentenanalyse (PCA) als multiparametrische Analyse und Mittel zur Dimensionalitätsreduktion (Abb. 1; Abb. S1). Dies gab uns ein völlig unverfälschtes Mittel zur phänotypischen Sortierung nach der Erfassung. Abnormal geformte Behandlungen wurden aufgedeckt, indem ein Ellipsoid um den Datencluster, der die Morphologie des Wildtyps im Hauptkomponentenraum repräsentiert, gefittet wurde und diejenigen ausgewählt wurden, die außerhalb dieser Cutoff-Zone lagen. Die x-, y- und z-Grenzen des Ellipsoids in jeder Dimension entsprechen einem Cutoff von 3 Standardabweichungen in den ersten drei Hauptkomponenten.

Auf diese Weise identifizierten wir etwa 111 Deletionsmutanten mit Formdefekten (siehe Tabelle S1 und Datensatz S1 im Ergänzungsmaterial). Unser Ansatz wurde durch die Bestätigung mehrerer bekannter Formmutanten validiert, darunter die tatA-Deletionsmutante, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie aufgrund einer falschen Lokalisierung der Amidasen im Periplasma lang und verkettet ist (8). Mutationen in holD, das für die DNA-Polymerase-III-ψ-Untereinheit kodiert, sind dafür bekannt, filamentöse Morphologien in E. coli zu verursachen (9). In der Tat steht die DNA-Replikation in einem synchronen Verhältnis zu den Prozessen der Zellteilung (10, 11), wobei Störungen in der DNA-Gyrase zu länglichen Zellen mit einzelnen Chromosomen und fehlenden Septen führen (12). Interessanterweise erzeugt die Pyridoxin-5′-Phosphat-Oxidase, die von pdxH kodiert wird, Pyridoxal-5′-Phosphat (PLP) und verursacht eine Verschiebung hin zu langen, gelegentlich verketteten Zellen. PLP ist ein Schlüssel-Cofaktor bei der Bereitstellung von d-Alanin und d-Glutamat für die Zellwand-Peptidoglykan-Synthese (13), und pdxH-Mutanten sind dafür bekannt, einen filamentösen Phänotyp zu haben (14). In ähnlicher Weise ist EnvC ein Aktivator von Zellwandumbauenzymen und dafür bekannt, filamentöses Wachstum zu verursachen (15), und RodZ ist an der Bildung von Seitenwänden beteiligt und dafür bekannt, sphärische Morphologie zu verursachen (16). Diese Phänotypen wurden alle in unserem Screening bestätigt. Überraschenderweise kodieren 52 Gene in unserer Liste für uncharakterisierte Proteine in E. coli, wobei viele davon mutmaßliche äußere oder zytoplasmatische Membranproteine sind (Tabelle S1). Somit identifizierte die beschriebene High-Content-Screening-Plattform nicht-essentielle Gene, die an der Aufrechterhaltung der Form beteiligt sind. Um biologische Prozesse, die mit diesen Mutationen interagieren, weiter zu charakterisieren und zu untersuchen, haben wir uns entschieden, ein genetisches Interaktions-Array mit einem Fokus auf diese Form-Gene zu erstellen.

Insgesamt wurden 60 Deletionen, die den stärksten Formdefekten entsprechen, als Abfragegene in einem synthetischen genetischen Array ausgewählt, von denen 7 nach der Methodik von Côté et al. (17) nicht gut konjugierten. Dies führte dazu, dass 53 Formgene von Interesse aus Tabelle S1 systematisch (5, 6) mit der Keio-Sammlung gekreuzt wurden, wodurch 1,7 × 107 Doppeldeletionsmutanten (siehe Datensatz S2 im ergänzenden Material) und ein synthetisches letales Interaktionsnetzwerk (siehe Abb. S3 im ergänzenden Material) erzeugt wurden. Wir stellten fest, dass Mutanten mit extremeren Formvariationen (z. B. pdxH-, rodZ-, envC- und gpmM-Mutanten) sich unter konventionellen Bedingungen nicht korrekt paarten und eine Paarung bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum erforderten. Als die Gene, die den synthetischen letalen Interaktionen zugrunde liegen, mit Gene Ontology (GO)-Termen für biologische Prozesse angereichert wurden, waren Transport- und Oxidations-Reduktionsprozesse überrepräsentiert (Abb. 2; Abb. S3). Dies basierte auf einem Histogramm der Häufigkeit des Auftretens für jeden GO-Term, wobei die Ontologien mit der EcoCyc (18) Pathway-Tools-Software (19) aufgerufen wurden. Interessanterweise ist der TolC-Außenmembrankanal mit hoher Frequenz vorhanden, was auf eine Beziehung zwischen der Effektivität des Medikamenten-Efflux-Systems (Acr, Mdt, Ent, Emr und Mac) und der Zellform hindeutet. Der vorhergesagte Symporter YdjN, der am häufigsten vorkommt, ist außerdem sowohl am L-Cystein-Transport als auch an der Reaktion auf oxidativen Stress beteiligt (20), biologische Prozesse, die zufällig in Abb. 2 angereichert sind. In der Tat waren Gene, die an Redox-Prozessen beteiligt sind, oft mit der Atmung verbunden, wie z. B. in den Fällen von ytfG, napG, cydB, nrdD, und nrdG. Dies ist besonders kurios, wenn man bedenkt, dass die Form/Krümmung der Membran eine Rolle bei der Funktion von membranassoziierten Proteinen spielt (21, 22), insbesondere angesichts der möglichen Beziehungen zwischen der Wirksamkeit von Medikamenten und der zellulären Atmung (23, 24). Es gibt jedoch nur ein begrenztes Verständnis des Zusammenhangs zwischen Zellform (oder Oberfläche) und Atmung. Wir haben ein bemerkenswertes Übergewicht an Interaktionen von Formgenen mit solchen, die an Atmungsfunktionen beteiligt sind, beobachtet. In der Arbeit von Côté et al. (17) wurden beispielsweise 82 Nährstoffstressgene mit der Keio-Sammlung gekreuzt und führten zu weniger als 200 synthetischen letalen Interaktionen mit Genen, die an Redox-Prozessen beteiligt sind, während im Gegensatz dazu etwa 800 solcher Interaktionen für 53 formstörende Gene beobachtet wurden (Abb. 2).

FIG S3

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Die Untersuchung der Keio-Sammlung auf Gendeletionen, die zu Formdefekten führen, ergab unerwartet eine Fülle von uncharakterisierten Genen. Die Verbindung dieser Gene mit ihrer Rolle in der Zellform kann bei der nachgelagerten funktionellen Klassifizierung helfen, insbesondere wenn gleichzeitig ihre genetischen Interaktionen profiliert werden. Insgesamt scheinen Gene, die an der Aufrechterhaltung der Form beteiligt sind, von Natur aus mit biologischen Prozessen wie Transport sowie Oxidation und Reduktion verbunden zu sein, aber es sind weitere Arbeiten erforderlich, um die Art der beobachteten Interaktionen zu klären. Von besonderem Interesse ist, ob physikalische Störungen wie Packungsgeometrie oder Krümmungsvariationen (21) mit Formdefekten einhergehen. Nichtsdestotrotz erweitert die hier vorgestellte Forschung unser Verständnis für die komplizierte Biologie, die die bakterielle Form definiert. Darüber hinaus ist die hier beschriebene High-Content-Mikroskopie-Plattform in hohem Maße für jede bakterielle Genom- oder chemische Bibliothek geeignet.